引物设计退火温度设置多少?

引物设计的退火温度一般在55到65摄氏度之间，具体数值取决于引物的长度和碱基组成。短引物或GC含量低的引物温度稍低，长引物或GC含量高的引物温度稍高。实验时可以先计算理论值，再通过梯度PCR优化，确保结合稳定且非特异性结合少。

退火温度过高会导致引物无法结合模板，退火温度过低则容易产生非特异性扩增。实际操作中，建议设置3到5个梯度温度，比如55、58、60、62、65摄氏度，通过电泳检测结果选择最合适的温度。温度选择还需考虑模板的复杂性和PCR仪的精度，确保实验重复性好。